ISO 21073:2019
(Main)Microscopes — Confocal microscopes — Optical data of fluorescence confocal microscopes for biological imaging
Microscopes — Confocal microscopes — Optical data of fluorescence confocal microscopes for biological imaging
This document specifies commonly used quantities regarding image performance in confocal laser scanning microscopy used for imaging of fluorescent biological specimens. This document applies only to confocal single point scanners using single photon excitation.
Microscopes — Microscopes confocaux — Données optiques des microscopes confocaux à fluorescence pour l'imagerie biologique
Le présent document précise les quantités généralement utilisées en termes de performances d'imagerie en microscopie confocale à balayage laser, utilisée pour l'imagerie d'échantillons biologiques fluorescents. Le présent document s'applique uniquement aux scanners à point confocal unique utilisant une excitation monophoton.
General Information
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21073
First edition
2019-12
Microscopes — Confocal microscopes
— Optical data of fluorescence confocal
microscopes for biological imaging
Microscopes — Microscopes confocaux — Données optiques des
microscopes confocaux à fluorescence pour l'imagerie biologique
Reference number
ISO 21073:2019(E)
©
ISO 2019
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Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Quantities . 2
4.1 Resolution and strength of optical sectioning . 2
4.1.1 General. 2
4.1.2 Definition of resolution . 3
4.1.3 Definition of strength of optical sectioning . 3
4.1.4 Measurement . 3
4.2 Uniformity of field and centring accuracy . 6
4.2.1 Definition of uniformity of field and centring accuracy . 6
4.2.2 Measurement . 6
4.3 Co-registration accuracy . 7
4.3.1 Definition of co-registration accuracy . 7
4.3.2 Measurement of co-registration accuracy . 8
4.4 Stability of illumination power . 8
4.4.1 General. 8
4.4.2 Measurement of stability of illumination power . 9
4.5 Field number of the confocal scan optic .10
4.5.1 General.10
4.5.2 Definition of field number of the confocal scan optic .10
4.5.3 Measurement of maximum diameter of scanned field .10
4.6 Scanning frequency .10
Annex A (informative) Theoretical resolution .13
Bibliography .15
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ISO 21073:2019(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 172 Optics and photonics, Subcommittee
SC 5 Microscopes and endoscopes.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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ISO 21073:2019(E)
Introduction
This document is intended to provide comparable specifications of confocal microscopes by microscope
manufacturers and to allow users to compare and monitor the imaging performance of their confocal
microscopes.
A confocal laser scanning microscope in this document comprises a laser illumination light source,
a scanning unit to deflect the excitation laser light, an objective and a detection unit consisting of a
detection pinhole and a photo detector.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21073:2019(E)
Microscopes — Confocal microscopes — Optical data of
fluorescence confocal microscopes for biological imaging
1 Scope
This document specifies commonly used quantities regarding image performance in confocal laser
scanning microscopy used for imaging of fluorescent biological specimens.
This document applies only to confocal single point scanners using single photon excitation.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10934-1, Optics and optical instruments — Vocabulary for microscopy — Part 1: Light microscopy
ISO 10934-2, Optics and optical instruments — Vocabulary for microscopy — Part 2: Advanced techniques
in light microscopy
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 10934-1, ISO 10934-2 and the
following apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
excitation wavelength
specific wavelength of light required to excite a fluorescent molecule, such as a fluorescent antibody or
fluorescent protein, to emit light at emission wavelengths
3.2
detection wavelength band
specific wavelength range of light collected by the photo detector
3.3
Airy unit
AU
diameter of the theoretical first minimum of the detection PSF in the low numerical aperture
approximation
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ISO 21073:2019(E)
λ
ref
AU=12, 2
NA
where
NA is the numerical aperture;
λ is the reference wavelength.
ref
3.4
pixel
smallest element of the digital image to which attributes are assigned
3.5
pixel size
shortest distance from the centre of one pixel to the centre of an adjacent pixel measured in object space
3.6
confocal point spread function
cPSF
product of the intensity point spread functions of the illuminating and detecting optical systems
[SOURCE: ISO 10934-2:2007 2.11.7, modified — the word “intensity” has been added, and “in a confocal
microscope” has been removed from the definition.]
3.7
coordinate system
right-handed Cartesian coordinate system defined by the optical axis as z-axis and the x-y plane
perpendicular to it
Note 1 to entry: The x and y coordinates are referred to as lateral coordinates, while z coordinates are referred
to as axial coordinates.
3.8
signal-to-noise ratio
ratio of signal to its noise
3.9
signal-to-background ratio
ratio of signal to the background
4 Quantities
4.1 Resolution and strength of optical sectioning
4.1.1 General
Resolution is the capacity for imaging fine detail which is determined by the minimum spatial separation
of two-point objects required for their observation as distinct objects. Various criteria have been
proposed to determine the resolution, e.g. the Abbe, Rayleigh, Schuster, Houston or Sparrow criteria. In
confocal microscopy, the resolution is commonly described by the full width at half maximum (FWHM)
of the confocal point spread function (cPSF).
In general, the minimum resolvable distance is the most relevant quantity regarding resolution. For
practical reasons this document defines resolution as given in 4.1.2.
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In practice, other factors such as noise and signal background, as well as the FWHM of the cPSF, affect
the minimum resolvable distance.
NOTE The term resolution is taken to refer to spatial, as opposed to temporal or spectral, resolution
throughout this document.
4.1.2 Definition of resolution
Resolution is defined as the full width at half maximum (FWHM) of the cPSF measured in the centre of
the object field.
The lateral resolution is given by the FWHM of the intensity signal along a lateral direction through the
centre of a fluorescent point-like object.
The axial resolution is given by the FWHM of the intensity signal along the axial direction through the
centre of a fluorescent point-like object.
4.1.3 Definition of strength of optical sectioning
The usefulness of confocal fluorescence microscopy is based to a large extent on the ability to suppress
out-of-focus light and thereby enable optical sectioning of the specimen. The strength of optical
sectioning is dependent on the spatial frequencies of the object scanned through the focus. A uniform
[3]
fluorescent planar object is widely used and generally accepted as a test object for optical sectioning .
Another useful depth discrimination criterion is the evaluation of the detected signal of a mirror
[4]
scanned through the focus . While using a thin uniform fluorescent layer as the test object is closer
to the considered application of the confocal microscope, measurement of a reflective planar object is
easier to implement. Both the thin uniform fluorescent layer and the reflective planar object represent a
step in the axial direction and therefore contain all spatial frequencies in the axial direction. Therefore,
the strength of optical sectioning is defined as the FWHM of the signal of a planar object scanned
through the focus as measured in the centre of the object field.
4.1.4 Measurement
The resolution is determined by imaging a small point-like object, e.g. a fluorescent microsphere. The
point-like object shall be sufficiently smaller than the expected resolution, i.e. the diameter of the object
should be smaller than half of the expected resolution. For the measurements of the resolution with
objectives designed for use with cover glass, fluorescent objects which are mounted as close as possible
to the cover glass should be chosen in order to minimize aberrations caused by the mounting medium.
The theoretical resolution, computed for an ideal confocal fluorescence microscope, is listed in Annex A.
In practice, the theoretical resolution is not achieved.
The strength of optical sectioning is determined as the FWHM of the signal of a thin uniform fluorescent
layer or reflective planar object scanned through the focus. The signal is measured in the centre of the
object field. The thin uniform fluorescent layer used for the measurement of the strength of optical
sectioning with objectives designed for use with cover glass should be located preferably on the cover
glass in order to minimize aberrations caused by the mounting medium. The thin uniform fluorescent
layer shall be significantly thinner than the expected strength of optical sectioning, i.e. the thickness
of the thin uniform fluorescent layer should be smaller than half of the expected strength of optical
sectioning.
For detection pinholes differing from a circular pinhole, the characteristic size of the pinhole
determining the resolution shall be identical to the diameter of a corresponding circular pinhole. The
largest dimension of such a pinhole shall not be more than 50 % longer than the smallest dimension of
the pinhole, e.g. the diagonal of a square pinhole is 41 % longer than its side.
NOTE 1 For highest resolution, the detection pinhole size theoretically needs to be infinitesimally small.
In order to obtain higher signal levels, the pinhole is opened up and commonly set to a diameter of 1 AU in
fluorescence microscopy. Although the lateral resolution achieved with a pinhole diameter of 1 AU is only slightly
better than the resolution of a widefield microscope, the confocal microscope still exhibits axial sectioning
capability.
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The pixel size shall be sufficiently smaller than the theoretical resolution, i.e. the pixel size should
be at least 10-fold smaller than the theoretical resolution. The scanned field shall be at least 10-fold
larger than the theoretical resolution. In the presence of side lobes greater than 50 % of the intensity
maximum of the cPSF, a resolution shall not be stated, since the FWHM of the cPSF is ambiguous.
NOTE 2 Diffraction-limited imaging performance of a confocal microscope results in sidelobes much lower
than 50 % of the intensity maximum of the cPSF.
Attention should be given to the signal-to-noise ratio when determining the FWHM of the cPSF. If
the FWHM of the cPSF cannot be clearly determined from a single measurement, sufficient multiple
measurements of one point-like object or multiple point-like objects shall be averaged.
In the recording of the cPSF the maximum and the minimum of the cPSF shall be included to avoid an
incorrect determination of the FWHM. This is illustrated in Figure 1 and Figure 2, where clipping of the
cPSF at a value of 0,2 results in a FWHM value FWHM2, which is about 14 % smaller than the correct
FWHM value of FWHM1.
Key
X distance from centre [a.u.]
Y intensity [a.u.]
Figure 1 — Determination of the correct FWHM value FWHM1 of the cPSF
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Key
X distance from centre [a.u.]
Y intensity [a.u.]
Figure 2 — Clipping of the cPSF results in an incorrect FWHM value of FWHM2
The FWHM shall be determined from the unprocessed recorded data, e.g. the data shall not be
deconvolved. Further, the signal transmission path shall be linear, e.g. the excitation of the fluorophore
and the signal from the detector shall not be saturated. A linear signal transmission path also involves
the signal transmission path in the confocal microscope system, especially the electronics and the
software.
The FWHM value shall be obtained by fitting a Gaussian function of the form
2
xx−
1
0
−
2 σ
Ix =⋅Ae +c
()
to the measured data, where A, x , σ and c are subject to be fitted. The FWHM is given by
0
FWHM = 22⋅⋅ln 22⋅≈σσ,35⋅
()
The Gaussian fitting shall be performed from the intensity profiles of a line, i.e. a width of one pixel.
The measurement of the resolution and the strength of optical sectioning is strongly dependent on
the following parameters, which shall be declared together with the resolution/strength of optical
sectioning statement:
— Excitation wavelength;
— Detection wavelength band;
— Manufacturer’s designation of the objective;
— Size of detection pinhole in Airy units and reference wavelength used to specify the Airy unit. In
general a detection pinhole size of 1 Airy unit should be used;
— Polarization state and, in the case of linear polarized excitation light the direction of polarization
with respect to the axis for which the lateral resolution is measured (see NOTE 3);
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— Diameter of the fluorescent point-like object used for the measurements;
— Type of planar object, i.e. reflective or fluorescent, used for the measurement of the strength of
optical sectioning;
— Distribution of laser illumination in the objective pupil; the distribution of the laser illumination
should be uniform or a Gaussian distribution and not a distribution of special shape, e.g. annular
illumination;
— The correlation coefficient as a measure of the goodness of fit.
In order to determine the correct values for resolution and strength of optical sectioning, the
instructions
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21073
Première édition
2019-12
Microscopes — Microscopes
confocaux — Données optiques des
microscopes confocaux à fluorescence
pour l'imagerie biologique
Microscopes — Confocal microscopes — Optical data of fluorescence
confocal microscopes for biological imaging
Numéro de référence
ISO 21073:2019(F)
©
ISO 2019
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DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2019
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
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CH-1214 Vernier, Genève
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Fax: +41 22 749 09 47
E-mail: copyright@iso.org
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Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Quantités . 2
4.1 Résolution et limite de sectionnement optique . 2
4.1.1 Généralités . 2
4.1.2 Définition de la résolution . 3
4.1.3 Définition de la limite de sectionnement optique . 3
4.1.4 Mesure . 3
4.2 Uniformité de champ et précision de centrage . 6
4.2.1 Définition d’uniformité de champ et précision de centrage . 6
4.2.2 Mesure . 6
4.3 Précision de co-enregistrement . 7
4.3.1 Définition de la précision de co-enregistrement . 7
4.3.2 Mesure de la précision de co-enregistrement . 8
4.4 Stabilité de la puissance d’éclairage . 9
4.4.1 Généralités . 9
4.4.2 Mesure de la stabilité de la puissance d’éclairage . 9
4.5 Nombre de champ de l’élément optique de balayage confocal .10
4.5.1 Généralités .10
4.5.2 Définition de nombre de champ de l’élément optique de balayage confocal .10
4.5.3 Mesure du diamètre maximum du champ balayé .10
4.6 Fréquence de balayage .11
Annexe A (informative) Résolution théorique .13
Bibliographie .15
© ISO 2019 – Tous droits réservés iii
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ISO 21073:2019(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l'intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l'Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC) voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ foreword .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 172 Optique et photonique,
sous-comité SC 5 Microscopes et endoscopes.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
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ISO 21073:2019(F)
Introduction
Ce document vise à fournir des spécifications comparables de microscopes confocaux par des fabricants
de microscopes et à permettre aux utilisateurs de comparer et surveiller les performances d’imagerie
de leurs microscopes confocaux.
Un microscope confocal à balayage laser dans le présent document comprend une source de lumière
d'illumination laser, une unité de balayage pour dévier la lumière laser d'excitation, un objectif et une
unité de détection composée d'un trou d'épingle de détection et d'un photodétecteur.
© ISO 2019 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 21073:2019(F)
Microscopes — Microscopes confocaux — Données
optiques des microscopes confocaux à fluorescence pour
l'imagerie biologique
1 Domaine d'application
Le présent document précise les quantités généralement utilisées en termes de performances
d’imagerie en microscopie confocale à balayage laser, utilisée pour l’imagerie d’échantillons biologiques
fluorescents.
Le présent document s’applique uniquement aux scanners à point confocal unique utilisant une
excitation monophoton.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 10934-1, Optique et instruments d'optique — Vocabulaire relatif à la microscopie — Partie 1:
Microscopie optique
ISO 10934-2, Optique et instruments d'optique — Vocabulaire relatif à la microscopie — Partie 2:
Techniques avancées en microscopie optique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l'ISO 10934-1, l’ISO 10934-2
et les suivants s’appliquent.
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
longueur d’onde d’excitation
longueur d'onde de lumière spécifique requise pour exciter une molécule fluorescente, telle qu’un
anticorps fluorescent ou une protéine fluorescente, afin d'émettre de la lumière à des longueurs d’onde
d’émission
3.2
bande de longueur d’onde de détection
plage spécifique de longueurs d’onde de lumière collectée par le photodétecteur
© ISO 2019 – Tous droits réservés 1
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ISO 21073:2019(F)
3.3
unité d’Airy
AU
diamètre du premier minimum théorique de la PSF de détection dans l'approximation d’ouverture
numérique basse
λ
ref
AU=12, 2
NA
où
NA est l’ouverture numérique
λ
est la longueur d’onde de référence
ref
3.4
pixel
plus petit élément de l’image numérique auquel sont assignés des attributs
3.5
taille de pixel
la plus courte distance entre le centre d’un pixel et le centre d’un pixel adjacent mesurée dans
l’espace d’objet
3.6
fonction d’étalement du point confocale
cPSF
produit des fonctions d’étalement du point en intensité des systèmes optiques d’illumination et de
détection
[SOURCE: ISO 10934-2:2007 2.11.7 modifié — le mot «intensité» a été ajouté, et «dans un microscope
confocal» a été retiré de la définition.]
3.7
système de coordonnées
système de coordonnées cartésien orthogonal droit défini par l’axe optique comme axe z et le plan x y
qui lui est perpendiculaire
Note 1 à l'article: Les coordonnées x et y sont appelées coordonnées latérales, tandis que les coordonnées z sont
appelées coordonnées axiales.
3.8
rapport signal sur bruit
rapport du signal à son bruit
3.9
rapport signal sur fond
rapport du signal à son fond
4 Quantités
4.1 Résolution et limite de sectionnement optique
4.1.1 Généralités
La résolution est la capacité à distinguer des détails fins, qui est déterminée par la séparation spatiale
minimale de deux points objets requise pour leur observation en tant qu’objets distincts. Différents
critères ont été proposés pour déterminer la résolution, par exemple, les critères d’Abbe, de Rayleigh,
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés
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ISO 21073:2019(F)
de Schuster, d’Houston ou de Sparrow. En microscopie confocale, la résolution est généralement décrite
par la largeur totale à mi-hauteur (FWHM) de la fonction d’étalement du point confocale (cPSF).
En général, la distance minimale de séparation est la quantité la plus pertinente en ce qui concerne
la résolution. Pour des raisons pratiques, le présent document définit la résolution telle qu'elle figure
en 4.1.2.
En pratique, d'autres facteurs tels que le bruit et le fond du signal, ainsi que la FWHM de la cPSF,
affectent la distance de résolution minimale.
NOTE Tout au long du présent document, le terme résolution désigne la résolution spatiale, par opposition à
la résolution temporelle ou spectrale.
4.1.2 Définition de la résolution
La résolution est définie comme la largeur totale à mi-hauteur (FWHM) de la cPSF mesurée au centre
du champ objet. La résolution latérale est donnée par la FWHM du signal d’intensité dans une direction
latérale à travers le centre d’un point objet fluorescent.
La résolution axiale est donnée par la FWHM du signal d’intensité dans la direction axiale à travers le
centre d’un point objet fluorescent.
4.1.3 Définition de la limite de sectionnement optique
L’utilité de la microscopie par fluorescence confocale repose en grande partie sur la capacité à éliminer
la lumière hors foyer et ainsi à permettre un sectionnement optique de l’échantillon. La limite de
sectionnement optique dépend des fréquences spatiales de l’objet balayé à travers le foyer. Un objet
plan fluorescent uniforme est couramment utilisé et généralement accepté comme objet d’essai pour
[3]
le sectionnement optique . Un autre critère de discrimination de profondeur utile est l’évaluation du
[4]
signal détecté d’un miroir balayé à travers le foyer . Bien que l’utilisation d’une fine couche fluorescente
uniforme comme objet d’essai est plus proche de l’application prévue du microscope confocal, la mesure
d’un objet plan réfléchissant est plus facile à mettre en œuvre. La fine couche fluorescente uniforme et
l’objet plan réfléchissant représentent tous deux une rupture dans la direction axiale et contiennent
donc toutes les fréquences spatiales dans la direction axiale. La limite de sectionnement optique est
ainsi définie comme la FWHM du signal d’un objet plan balayé à travers le foyer telle que mesurée au
centre du champ objet.
4.1.4 Mesure
La résolution est déterminée par imagerie d’un petit point objet, par exemple une microsphère
fluorescente. Le point objet doit être d’une taille suffisamment inférieure à la résolution attendue, par
exemple le diamètre de l’objet doit être inférieur à la moitié de la résolution attendue. Pour les mesures
de la résolution avec des objectifs conçus pour une utilisation avec une lamelle en verre couvre objet,
les objets fluorescents montés aussi près que possible de la lamelle en verre couvre objet doivent être
choisis de façon à minimiser les aberrations causées par le milieu de montage. La résolution théorique,
calculée pour un microscope confocal à fluorescence idéal, est listée dans l’Annexe A. En pratique, la
résolution théorique n’est pas atteinte.
La limite de sectionnement optique est déterminée comme la FWHM du signal d’une fine couche
fluorescente uniforme ou d’un objet plan réfléchissant balayé à travers le foyer. Le signal est mesuré
au centre du champ objet. La fine couche fluorescente uniforme utilisée pour la mesure de la limite de
sectionnement optique avec des objectifs conçus pour une utilisation avec un verre protecteur doit être
située de préférence sur le verre protecteur afin de minimiser les aberrations causées par le milieu
de montage. La fine couche fluorescente uniforme doit être significativement plus fine que la limite
de sectionnement attendue, c'est-à-dire qu'il est recommandé que la fine couche fluorescente uniforme
soit plus petite que la moitié de la limite de sectionnement optique attendue.
Pour les trous d’épingle de détection différents d’un trou d’épingle circulaire, la taille caractéristique du
trou d’épingle déterminant la résolution doit être identique au diamètre d’un trou d’épingle circulaire
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correspondant. La dimension maximale d’un tel trou d’épingle ne doit pas dépasser 50 % de la longueur
de la plus petite dimension du trou d’épingle, par exemple la diagonale d’un trou d’épingle carré est
41 % plus longue que son côté.
NOTE 1 Pour une résolution maximale, la taille du trou d’épingle de détection doit théoriquement être
infinitésimale. Pour obtenir des niveaux de signal plus élevés, le trou d’épingle est ouvert et généralement réglé
à un diamètre de 1 AU en microscopie par fluorescence. Le microscope confocal démontre une bonne capacité de
sectionnement axial même si la résolution latérale obtenue avec un diamètre de trou d’épingle de 1 AU n’est que
légèrement meilleure que la résolution d’un microscope à champ large.
La taille de pixel doit être suffisamment inférieure à la résolution théorique, par exemple la taille de
pixel doit être au moins 10 fois plus petite que la résolution théorique. Le champ balayé doit être au
moins 10 fois plus grand que la résolution théorique. En présence de lobes latéraux supérieurs à 50 %
de l’intensité maximale de la cPSF, une résolution ne doit pas être indiquée, car la FWHM de la cPSF est
ambiguë.
NOTE 2 Les performances d’imagerie limitées par la diffraction d’un microscope confocal induisent des lobes
latéraux largement inférieurs à 50 % de l’intensité maximale de la cPSF.
Il convient de porter une attention au rapport signal sur bruit lors de la détermination de la FWHM de la
cPSF. Si la FWHM de la cPSF ne peut pas être clairement déterminée par une mesure unique, la moyenne
doit être faite sur un nombre suffisant de mesures multiples d’un ou de plusieurs objet(s) ponctuel(s).
Le maximum et le minimum de la cPSF doivent être inclus à l’enregistrement de la cPSF afin d’éviter une
détermination incorrecte de la FWHM. Cela est illustré à la Figure 1 et la Figure 2, qui montrent qu’un
écrêtage de la cPSF à une valeur de 0,2 entraîne une valeur FWHM «FWHM2» environ 14 % plus petite
que la valeur FWHM correcte de «FWHM1 ».
Légende
X distance à partir du centre [a.u.]
Y intensité [a.u.]
Figure 1 — Détermination de la valeur FWHM correcte «FWHM1» de la cPSF
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Légende
X distance à partir du centre [a.u.]
Y intensité [a.u.]
Figure 2 — Un écrêtage de la cPSF entraîne une valeur FWHM incorrecte de «FWHM2»
La FWHM doit être déterminée à partir des données enregistrées non traitées, c’est-à-dire que les
données ne doivent pas être déconvoluées. Le trajet de transmission du signal doit en outre être linéaire,
c’est-à-dire que l’excitation du fluorophore et le signal issu du détecteur ne doivent pas être saturés. Un
trajet de transmission linéaire du signal inclut également le trajet de transmission du signal dans le
système de microscope confocal, en particulier l’électronique et le logiciel.
La valeur FWHM doit être obtenue en adaptant une fonction gaussienne de forme
2
xx−
1
0
−
2 σ
Ix =⋅Ae +c
()
aux données mesurées, où A, x , σ et c doivent être ajustés. La FWHM est donnée par
0
FWHM = 22⋅⋅ln 22⋅≈σσ,35⋅
()
L'ajustement gaussien doit être effectué à partir des profils d'intensité d'une ligne, c'est-à-dire d'une
largeur d'un pixel.
La mesure de la résolution et de la limite de sectionnement optique dépend en grande partie des
paramètres suivants, qui ont été déclarés avec les valeurs nominales de résolution/limite de
sectionnement optique:
— Longueur d’onde d’excitation;
— Bande de longueur d’onde de détection;
— Désignation de l’objectif par le fabricant;
— Taille du trou d’épingle de détection en unités d’Airy et longueur d’onde de référence utilisée pour
spécifier l’unité d’Airy. De manière générale, une taille de trou d’épingle de détection de 1 AU doit
être utilisée;
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— État de polarisation et, en cas de lumière d’excitation polarisée linéairement, la direction de
polarisation par rapport à l’axe pour lequel la résolution latérale est mesurée (voir NOTE 3);
— Diamètre de l’objet ponctuel fluorescent utilisé pour les mesures;
— Type d’objet plan, par exemple réfléchissant ou fluorescent, utilisé pour la mesure de la limite de
sectionnement optique.
— Distribution de l’illumination laser dans la pupille de l’objectif; la distribution de l’illumination
laser doit être uniforme ou gaussienne et non une distribution de forme spéciale, par exemple un
éclairage annulaire.
— Le coefficient de corrélation comme mesure de la qualité de l'ajustement.
Les consignes du fabricant doivent être respectées afin de déterminer les valeurs correctes de résolution
et de limite de sectionnement optique. Cela s'applique en particulier pour le milieu d’immersion, le
milieu de montage ou le tampon d’imagerie, le type et l'épaisseur de lamelle en verre couvre objet, la
température et l'orientation de l’échantillon. Si l'objectif est équipé d'une bague de correction, il est
important qu'il soit réglé à la bonne position.
NOTE 3 Pour des objectifs à grande ouverture numérique et une lumière d’excitation polarisée linéairement, la
FWHM dans la direction perpendiculaire à la direction de polarisation est inférieure à la FWHM dans la direction
de polarisation.
4.2 Uniformité de champ et précision de centrage
4.2.1 Définition d’uniformité de champ et précision de centrage
Il convient que le microscope confocal offre un certain degré d’uniformité d’image afin de permettre
l’examen de l’objet, sans quoi des détails de l’objet risquent de ne pas être détectés.
L’uniformité de la luminosité dans le champ d’image est exprimée avec
luminositéminimaledanslechampimage
uniformité[%]=100×
luminossitémaximaledanslechampimage
Le centrage de la luminosité maximale dans l'image est exprimé par la précision de centrage CA et est
donné par la formule suivante:
2
22
CA % =−100 100×−xx +−yy ×
[] () ()
maxcentremax centre
22
wh+
où
{x , y } sont les coordonnées de la luminosité maximale;
max max
{x , y } sont les coordonnées du centre du champ;
centre centre
w et h sont la largeur et la hauteur du champ, respectivement.
4.2.2 Mesure
Les mesures d’uniformité et de précision de centrage doivent être réalisées avec un échantillon
fluorescent homogène, par exemple une solution de marqueurs fluorescents. Les solutions de marqueurs
sont généralement préférables aux échantillons solides, car les fluorophores photoblanchis dans le
champ image sont remplacés par des fluorophores non blanchis en raison de la diffusion.
Le diamètre du trou d’épingle doit être réglé à la même valeur que celle utilisée pour les mesures de
résolution. Le nombre minimal de pixels utilisé pour la mesure doit être de 128 pixels × 128 pixels.
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Au cours de la mesure, il convient de garantir que les données complètes enregistrées proviennent
de la région fluorescente homogène de l’échantillon afin d’éviter tout mauvais jugement, qui pourrait
être causé par exemple par la courbure de champ des éléments d’optique ou un échantillon basculé.
Le rapport signal sur bruit doit être suffisamment élevé pour clairement déterminer l’uniformité et la
précision de centrage. Le rapport signal sur bruit est suffisamment élevé si l’uniformité varie de moins
de 5 points de pourcentage quand l’intensité d’éclairage est modifiée par un facteur d’au moins 1,5. Le
trajet de transmission du signal doit en outre être linéaire c’est-à-dire que l’excitation du fluorophore et
le signal issu du détecteur ne doivent pas être saturés. Un trajet de transmission linéaire du signal inclut
également le trajet de transmission du signal dans le système de microscope confocal, en particulier
l’électronique et le logiciel.
Si des informations sur l’uniformité d’image et/ou sur la précision de centrage sont fournies à
l’utilisateur, elles peuvent l’être conformément aux définitions fournies dans 4.2.1 et contiennent les
données supplémentaires suivantes:
— Nombre de champ de l’élément optique de balayage confocal (voir 4.5) et pourcentage du nombre de
champ, qui correspond au champ balayé de la mesure;
— Informations sur la longueur d’onde d’excitation;
— Informations sur la bande de longueur d’onde de détection;
— Désignation de l’objectif par le fabricant;
— Taille du trou d’épingle de détection en unités d’Airy et longueur d’onde de référence utilisée pour
spécifier l’unité d’Airy.
Afin de déterminer les valeurs correctes pour l'uniformité du champ et la précision de centrage, les
instructions du fabricant doivent être respectées. Cela s'applique en particulier au milieu d'immersion,
au type et à l'épaisseur de la lamelle en verre couvre objet, à la température.
4.3 Précision de co-enregistrement
4.3.1 Définition de la précision de co-enregistrement
La précision de co-enregistrement est la précision avec laquelle un système de microscope confocal
capture un objet fluorescent avec une excitation et des longueurs d’onde d’émission différentes à la
même position dans l’image. La distance spatiale des positions dans l’image de l’objet fluorescent située
au centre du champ objet pour une excitation et des bandes de longueur d’onde de détection différentes
est donc notée comme précision de co-enregistrement. Cela diffère du fait que pour des longueurs
d’onde différentes, la position latérale d’un objet dans l’image peut varier sur le champ de l’image en
raison de l’aberration chromatique latérale du système optique. La précision de co-enregistrement
doit être calculée en fonction du maximum d’intensité ou du centre de gravité d’intensité de l’image de
l’objet pour les différentes longueurs d’onde.
La précision de co-enregistrement latérale est exprimée par
2 2
Δ =−xx +−yy
() ()
lateral λλ12 λλ12
et la précision de co-enregistrement axiale est exprimée par
2
Δ =−zz
()
axial λλ12
où
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x est la coordonnée x de la position de l’image de l’objet pour la bande de longueur d’onde de
λ1
détection λ
1
y est la coordonnée y de la position de l’image de l’objet pour la bande de longueur d’onde de
λ1
détection λ
1
z est la coordonnée z de la position de l’image de l’objet pour la bande de longueur d’onde de
λ1
détection λ
1
x est la coordonnée x de la position de l’image de l’objet pour la bande de longueur d’onde de
λ2
détection λ
2
y est la coordonnée y de la position de l’image de l’objet pour la bande de longueur d’onde de
λ2
détection λ
2
z est la coordonnée z de la position de l’image de l’objet pour la bande de longueur d’onde de
λ2
détection λ
2
4.3.2 Mesure de la précision de co-enregistrement
La mesure de la précision de co-enregistrement doit être réalisée avec des objets teintés avec des
marqueurs fluorescents émettant sur une large gamme de longueurs d’onde ou plusieurs bandes de
longueurs d’onde. Les objets doivent être situés au centre du champ objet et être de taille inférieure par
rapport à la résolution ou avoir la même densité de distribution pour différents marqueurs fluorescents
sur l’ensemble de leur volume. Les objets fluorescents homogènes générant plusieurs bandes d’excitation
et fluorescentes sont des objets adaptés pour des mesures de co-enregistrement.
Il convient que les objets utilisés pour les mesures avec des objectifs conçus pour une utilisation avec
une lamelle en verre couvre objet soient près du verre protecteur afin d’éviter les aberrations causées
par le milieu de montage. L’objet doit également être au centre du champ objet. La taille de pixel doit
être suffisamment inférieure à la résolution attendue de l’objectif. La taille de pixel doit être au moins
10 fois inférieure à la résolution attendue de l’objectif.
Une pile de données tridimensionnelle (x, y, z) contenant l’objet doit être enregistrée. Les positions de
l’objet pour différentes bandes fluorescentes doivent être déterminées en calculant le centre de gravité
d’intensité ou en calculant le maximum par interpolation si la structure d’objet est connue, par exemple
comme dans le cas d’une microsphère fluorescente.
Si la position de l’objet ne peut pas être cla
...
Questions, Comments and Discussion
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