ISO 9936:2006
(Main)Animal and vegetable fats and oils — Determination of tocopherol and tocotrienol contents by high-performance liquid chromatography
Animal and vegetable fats and oils — Determination of tocopherol and tocotrienol contents by high-performance liquid chromatography
ISO 9936:2006 specifies a method for the determination of the contents of free alpha-, beta-, gamma- and delta-tocopherols and tocotrienols in animal and vegetable fats and oils by high-performance liquid chromatography. For products containing tocopherol or tocotrienol esters, it is necessary to carry out a preliminary saponification.
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination des teneurs en tocophérols et en tocotriénols par chromatographie en phase liquide à haute performance
L'ISO 9936:2006 spécifie une méthode pour la détermination des teneurs en alpha-, bêta-, gamma- et delta-tocophérols et tocotriénols libres des graisses et des huiles d'origines animale et végétale, par chromatographie en phase liquide haute performance (CLHP). Pour les produits contenant des esters de tocophérols ou de tocotriénols, il est nécessaire qu'ils subissent une saponification préalable.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 9936
Второе издание
2006-04-15
Жиры и масла животные и
растительные. Определение
содержания токоферолов и
токотриенолов высокоэффективной
жидкостной хроматографией
Animal and vegetable fats and oils — Determination of tocopherol and
tocotrienol contents by high-performance liquid chromatography
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 9936:2006(R)
©
ISO 2006
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 9936:2006(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на интегрированные шрифты и они не будут установлены на компьютере, на котором ведется редактирование. В
случае загрузки настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение
лицензионных условий фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe - торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованные для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2006
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO по адресу ниже или членов ISO в стране регистрации пребывания.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO - Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 9936:2006(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .1
4 Принцип.1
5 Реактивы .2
6 Аппаратура.2
7 Отбор проб.3
8 Подготовка пробы для испытания .3
9 Методика .4
9.1 Приготовление калибровочных растворов .4
9.2 Оптимизация рабочих параметров.5
9.3 Приготовление испытуемого раствора .5
9.4 Определение.5
10 Выражение результатов .6
11 Прецизионность.7
11.1 Межлабораторное испытание.7
11.2 Повторяемость .7
11.3 Воспроизводимость .7
12 Протокол испытания.7
Приложение А (информативное) Примеры хроматограмм.8
Приложение В (информативное) Омыление.10
Приложение С (информативное) Результаты межлабораторных испытаний.12
Библиография.19
© ISO - Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 9936:2006(R)
Предисловие
ISO (Международная организация по стандартизации) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член ISO, заинтересованный
в деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в
этом комитете. Международные организации, правительственные и неправительственные, имеющие
связи с ISO, также принимают участие в работах. ISO непосредственно сотрудничает с
Международной электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам электротехнической
стандартизации.
Международные стандарты разрабатываются в соответствии с правилами, приведенными в
Директивах ISO/IEC, Часть 2.
Основная задача технических комитетов состоит в подготовке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, одобренные техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам
на голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения, по
меньшей мере, 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего документа могут быть объектом патентных
прав. ISO не должен нести ответственность за идентификацию какого-либо одного или всех патентных
прав.
ISO 9936 подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты, Подкомитетом SC 11,
Животные и растительные жиры и масла.
Настоящее второе издание отменяет и заменяет первое издание (ISO 9936:1997), которое было
подвергнуто техническому пересмотру.
iv © ISO – Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 9936:2006(R)
Жиры и масла животные и растительные. Определение
содержания токоферолов и токотриенолов
высокоэффективной жидкостной хроматографией
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод определения содержания свободных α-, β-,
γ-, и δ-токоферолов и токотриенолов (называемых в совокупности токолами) в животных и
растительных жирах и маслах (называемых в дальнейшем жирами) с помощью высокоэффективной
жидкостной хроматографии (HPLC).
Для продуктов, содержащих эфиры токоферолов и токотриенолов, необходимо проводить
предварительное омыление.
ПРИМЕЧАНИЕ Подходящий метод, включающий процедуру холодного омыления, описан в Приложении B
только для информации.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные нормативные документы являются обязательными при применении данного
документа. Для жестких ссылок применяется только цитированное издание документа. Для плавающих
ссылок необходимо использовать самое последнее издание нормативного ссылочного документа
(включая любые изменения).
ISO 661, Жиры и масла животные и растительные. Подготовка пробы для испытания
3 Термины и определения
Применительно к настоящему документу используются следующие термины и определения.
3.1
содержание токолов
tocol content
массовая доля отдельных токолов, определенных по методу, установленному в этом международном
стандарте
ПРИМЕЧАНИЕ Указанное содержание выражается в миллиграммах на килограмм в виде целого числа.
4 Принцип
Растворяют пробу для анализа в н-гептане и разделяют отдельные токолы с помощью
высокоэффективной жидкостной хроматографии. Рассчитывают содержание каждого токола с
помощью калибровочных коэффициентов, определенных по калибровочным растворам.
© ISO – Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 9936:2006(R)
5 Реактивы
Используют реактивы только класса чистоты HPLC или эквивалентного.
5.1 Стандарты α-, β-, γ- и δ-токоферолов и токотриенолов.
При отсутствии стандартов токоферолов можно использовать смесь масел из зародышей пшеницы и
сои для идентификации α-, β-, γ- и δ-токоферолов.
При отсутствии стандартов токотриенолов можно использовать пальмовое масло для идентификации
α- и γ-токотриенолов. Полученные хроматограммы могут быть использованы для идентификации пиков
на хроматограммах пробы для испытания, в этом случае следует использовать калибровочные
коэффициенты для соответствующих токоферолов.
1)
ПРИМЕЧАНИЕ Стандарты α-, β-, γ- и δ-токоферолов и токотриенолов можно получить в фирме Merck ;
α-токоферол может быть получен от различных поставщиков. Было установлено, что чистота некоторых
имеющихся в продаже стандартов токоферолов может изменяться от 85 % до 100 %. Поэтому важно определять
концентрацию приготовленных калибровочных растворов с помощью УФ- спектрометрии (см. 9.1.1).
5.2 Тетрагидрофуран, фильтрованный через найлоновый HPLC фильтр (0,45 мкм).
5.3 н-Гептан, фильтрованный через найлоновый HPLC фильтр (0,45 мкм).
5.4 Подвижная фаза для HPLC: следует использовать любую подходящую смесь растворителей
(см. Таблицу C.3), которая продемонстрировала такую же степень хроматографического разделения
пиков, какая показана в Таблице 2 (относительное время удерживания токоферолов и токотриенолов)
и в Приложении A (хроматограммы смеси растительных масел).
Приготовление подходящей подвижной фазы, 3,85 % (объемная доля) раствора тетрагидрофурана в
н-гептане, указано ниже. С помощью градуированного цилиндра вместимостью 1 000 мл (6.5)
переносят 1 000 мл н-гептана (5.3) в склянку вместимостью 2 л. Дважды добавляют по 20 мл
тетрагидрофурана (5.2), используя мерную пипетку вместимостью 20 мл (6.6). Гомогенизируют
подвижную фазу на ультразвуковой ванне (6.8) в течение15 мин.
5.5 Метанол
6 Аппаратура
Используют обычную лабораторную аппаратуру и, в частности, следующую.
6.1 HPLC-система, состоящая из насоса высокого давления, устройства ввода пробы, термостата
колонки, отрегулированного на температуру 25 °C (необязательно), флуоресцентного детектора с
длиной волны возбуждения, установленной на 295 нм, и длиной волны излучения на 330 нм, а также
записывающего интегратора.
При отсутствии флуоресцентного детектора допускается, но не рекомендуется использовать
ультрафиолетовый (UV) детектор. Однако при использовании UV-детектора следует установить длину
волны на 292 нм.
1) Набор токоферолов фирмы Merck 613424 имеется в Calbiochem (www.calbiochem.com). Он содержит по одной
50 мг-ампуле DL-α-токоферола, D-β-токоферола, D-γ-токоферола и D-δ-токоферола чистотой 95 % по HPLC (для
каждого компонента). Набор токотриенолов фирмы Merck 613432 имеется также в Calbiochem. Он содержит по
одной 50 мг-ампуле α-токотриенола, β- токотриенола, γ- токотриенола и δ- токотриенола чистотой 95 % по HPLC
(75 % для γ- токотриенола).
Эта информация дается для удобства пользователей данного международного стандарта и не означает
одобрения этих продуктов со стороны ISO.
2 © ISO - Все права сохраняются
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 9936:2006(R)
6.2 Аналитическая колонка для HPLC, допускается два типа:
⎯ 250 мм × 4 мм, заполненная микрочастицами диола со средним размером частиц приблизительно
5 мкм, или
⎯ 250 мм × 4,6 мм, заполненная микрочастицами диоксида кремния со средним размером частиц
приблизительно 5 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Подходящим имеющимся в продаже наполнителем для колонки с диол-диоксидом кремния
является 5 мкм LiChrospher 100 Diol; подходящими имеющимися в продаже наполнителями для колонки с
2)
диоксидом кремния являются 5 мкм LiChrosob SI 60 и Kromasil 100 . Если ожидается присутствие β-токотриенола
в пробе, то предпочтительнее колонка с диол-диоксидом кремния, так как γ-токоферол и β-токотриенол совместно
элюируются при использовании колонки с диоксидом кремния.
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Длина и диаметр колонки могут изменяться в зависимости от используемой методики HPLC.
6.3 UV-спектрометр, приспособленный для абсолютного измерения оптической плотности при
точно заданной длине волны в кювете с длиной оптического пути 10 мм.
6.4 Роторный испаритель.
6.5 Градуированный цилиндр, вместимостью 1 000 мл.
6.6 Мерные пипетки, вместимостью 5 мл, 10 мл и 20 мл.
6.7 Мерные колбы, вместимостью 50 мл и 25 мл.
6.8 Ультразвуковая ванна.
7 Отбор проб
В лабораторию следует поставлять представительную пробу. Она не должна подвергаться порче или
изменению во время транспортировки или хранения.
Отбор проб не включен в метод, установленный в этом международном стандарте. Рекомендуемый
метод отбора проб приводится в ISO 5555.
8 Подготовка пробы для испытания
В случае жидких лабораторных проб готовят пробу для испытания путем гомогенизации, как описано в
ISO 661, за исключением того, что следует избегать фильтрования.
В случае твердых проб переносят представительную часть (т.е не менее 10 % по массе лабораторной
пробы) в стеклянный химический стакан и тщательно гомогенизируют, растапливая ее при осторожном
перемешивании на водяной бане при температуре не выше 40 °C.
Подготовку проб для испытания следует проводить, насколько это возможно, в приглушенном свете и
ни в коем случае не при прямом солнечном свете.
2) Эти типы колонок – примеры соответствующих изделий, которые имеются в продаже.
Эта информация дается для удобства пользователей данного международного стандарта и не означает
одобрения этих продуктов со стороны ISO.
© ISO – Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 9936:2006(R)
9 Методика
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ — Обычно окисление токолов в процессе анализа приводит к заниженным
результатам. Скорость окисления увеличивается в присутствии щелочей или под действием
тепла или света, поэтому следует применять меры, предохраняющие от таких воздействий.
9.1 Приготовление калибровочных растворов
9.1.1 Основные калибровочные растворы
Готовят основной раствор каждого токола, взвешивая 10 мг ± 1 мг стандарта (5.1) в мерную колбу
вместимостью 50 мл и разбавляя до метки н-гептаном (5.3).
Отбирают пипеткой 5 мл этого раствора в круглодонную колбу из янтарного стекла и удаляют весь
н-гептан на роторном испарителе (6.4) под вакуумом при температуре не выше 40 °C. Как только весь
растворитель будет удален, восстанавливают атмосферное давление с помощью азота и отсоединяют
колбу от испарителя. Вносят пипеткой в колбу 10 мл метанола (5.5) и перемешивают с образованием
завихрения до растворения остатка. Измеряют максимальную оптическую плотность этого раствора в
диапазоне длин волн от 270 нм до 310 нм (см. соответствующую длину волны в Таблице 1), используя
UV-спектрометр (6.3) в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Измеренная оптическая плотность
должна находиться в диапазоне от 0,2 до 0,8. Рассчитывают концентрацию (в микрограммах на
миллилитр) путем деления значения оптической плотности на соответствующий коэффициент деления,
приведенный в Таблице 1.
Таблица 1 — Коэффициенты деления
Длина волны
Токоферол Коэффициент деления
нм
292 α-токоферол 0,007 6
296 β- токоферол 0,008 9
298 γ- токоферол 0,009 1
298 0,008 7
δ- токоферол
ПРИМЕЧАНИЕ Приведенные коэффициенты получены из значений E (1 %/1 см) для
токоферолов. Например, значение E (1 %/1 см) α- токоферола равняется 76 при 292 нм (в
метаноле); следовательно раствор α-токоферола концентрацией 1 мкг/мл будет иметь
оптическую плотность 0,007 6 при 292 нм.
9.1.2 Стандартный раствор
Подходящий стандартный раствор следует готовить в соответствии с чувствительностью
используемого флуоресцентного детектора.
В качестве примера приводится следующая процедура приготовления рабочего раствора: смешивают
соответствующие объемы, например, по 1 мл, основных калибровочных растворов (9.1.1) для
получения смешанного стандартного раствора токолов и разбавляют н-гептаном для получения
раствора, содержащего от 1 мкг до 5 мкг каждого стандарта на миллилитр.
Каждый рабочий день должен готовиться свежий стандартный раствор.
Защищают все растворы от света и хранят при температуре от 0 °C до 4 °C.
Основные стандартные растворы могут удовлетворительно сохраняться в посуде из янтарного стекла
в течение 1 недели при охлаждении. Колбы можно заворачивать в алюминиевую фольгу.
ПРИМЕЧАНИЕ При использовании UV-детектора может потребоваться раствор большей концентрации.
4 © ISO - Все права сохраняются
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 9936:2006(R)
9.2 Оптимизация рабочих параметров
9.2.1 Если используется новая колонка (6.2) или колонка с неизвестной предысторией, или есть
какая-либо другая причина для ее кондиционирования, промывают и выдерживают колонку в течение
приблизительно 10 мин в метаноле, затем дихлорметане и затем в н-гептане при скорости потока
приблизительно 1 мл/мин.
Прокачивают через колонку подвижную фазу для HPLC (5.4) со скоростью потока 1 мл/мин в течение,
по меньшей мере, 30 мин.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ — Метанол и дихлорметан опасны для человека и окружающей среды.
Следует обращаться с ними с осторожностью.
9.2.2 Вводят в колонку 10 мкл или 20 мкл (в зависимости от чувствительности детектора)
стандартного раствора (9.1.2) и, при необходимости, регулируют содержание тетрагидрофурана в
подвижной фазе и скорость потока до достижения следующих условий:
a) время удерживания α-токоферола от 8 мин до 12 мин;
b) фактор разрешения RF для разделения β- и γ-токоферолов не менее 1,0; т.е. разделение почти на
уровне базовой линии, где RF рассчитывают по следующей формуле:
ddII− I
() ()
rr
RF=
⎡⎤
0,5⋅+bbI II
() ()
⎣⎦
где
d (I) расстояние удерживания γ-токоферола;
r
d (II) расстояние удерживания β-токоферола;
r
b(I) ширина пика γ-токоферола в основании;
b(II) ширина пика β- токоферола в основании.
9.2.3 Выбирают оптимальные установочные параметры для системы обнаружения и интеграции.
Вводят 10 мкл или 20 мкл стандартного раствора (9.1.2). Повторяют ввод и проверяют, что получились
воспроизводимые хроматограммы.
9.3 Приготовление испытуемого раствора
В зависимости от концентрации токолов (9.1.2) взвешивают с точностью до 1 мг 0,25 г ± 0,1 г пробы
для испытания (Раздел 8) в мерной колбе с одной меткой вместимостью 25 мл. Добавляют некоторое
количество н-гептана (5.3), перемешивая содержимое с образованием завихрения до растворения
пробы для анализа, и разбавляют до метки тем же растворителем. Если раствор не прозрачный,
фильтруют его через HPLC найлоновый фильтр 0,45 мкм.
Важно, чтобы испытуемые растворы были защищены от света до проведения анализа, а сам анализ
проводился в день их приготовления.
ПРИМЕЧАНИЕ Может возникнуть н
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 9936
Second edition
2006-04-15
Animal and vegetable fats and oils —
Determination of tocopherol and
tocotrienol contents by high-performance
liquid chromatography
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination des teneurs
en tocophérols et en tocotriénols par chromatographie en phase liquide
à haute performance
Reference number
ISO 9936:2006(E)
©
ISO 2006
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 9936:2006(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
© ISO 2006
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2006 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 9936:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 1
5 Reagents. 2
6 Apparatus . 2
7 Sampling. 3
8 Preparation of test sample. 3
9 Procedure . 4
9.1 Preparation of calibration solutions . 4
9.2 Optimization of working parameters . 5
9.3 Preparation of test solution . 5
9.4 Determination. 5
10 Expression of results . 6
11 Precision. 7
11.1 Interlaboratory test . 7
11.2 Repeatability. 7
11.3 Reproducibility. 7
12 Test report . 7
Annex A (informative) Examples of chromatograms. 8
Annex B (informative) Saponification . 10
Annex C (informative) Results of interlaboratory tests. 12
Bibliography . 17
© ISO 2006 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 9936:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 9936 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal
and vegetable fats and oils.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 9936:1997), which has been technically revised.
iv © ISO 2006 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 9936:2006(E)
Animal and vegetable fats and oils — Determination of
tocopherol and tocotrienol contents by high-performance liquid
chromatography
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the contents of free α-, β-, γ-, and
δ-tocopherols and tocotrienols (referred to jointly as tocols) in animal and vegetable fats and oils (referred to
hereinafter as fats) by high-performance liquid chromatography (HPLC).
For products containing tocopherol or tocotrienol esters, it is necessary to carry out a preliminary
saponification.
NOTE A suitable method involving a cold saponification procedure is described in Annex B for information only.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
tocol content
mass fraction of the individual tocols, determined using the method specified in this International Standard
NOTE The content is expressed in milligrams per kilogram as a whole number.
4 Principle
A test portion is dissolved in n-heptane and the individual tocols are separated by high-performance liquid
chromatography. The content of each tocol is calculated using calibration factors determined from calibration
solutions.
© ISO 2006 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 9936:2006(E)
5 Reagents
Use only reagents of HPLC grade or equivalent.
5.1 α-, β-, γ- and δ-tocopherol and tocotrienol standards.
If tocopherol standards are not available, a blend of wheat germ and soya bean oil may be used to identify
α-, β-, γ- and δ-tocopherols.
If tocotrienol standards are not available, palm oil may be used to identify α- and γ-tocotrienols. The
chromatograms obtained can be used to assist peak identification in test sample chromatograms, in which
case the calibration factors for the corresponding tocopherols should be used.
1)
NOTE α-, β-, γ- and δ-tocopherol and tocotrienol standards can be obtained from Merck ; α-tocopherol can be
obtained from various suppliers. It has been reported that the purity of some commercially available tocopherol standards
may vary between 85 % and 100 %. Thus, it is important to determine the concentration of prepared calibration solutions
by UV spectrometry (see 9.1.1).
5.2 Tetrahydrofuran, filtered through an HPLC nylon filter (0,45 µm).
5.3 n-Heptane, filtered through an HPLC nylon filter (0,45 µm).
5.4 HPLC mobile phase: any suitable mixture of solvents that has been proved to reach a
chromatographic resolution of peaks as good as the one presented in Table 2 (relative retention time of
tocopherols and tocotrienols) and in Annex A (chromatograms of a mixture of vegetable oils), should be used
(see Table C.3).
The preparation of a suitable mobile phase, 3,85 % (volume fraction) tetrahydrofuran solution in n-heptane, is
as follows. Using a 1 000 ml graduated cylinder (6.5), introduce 1 000 ml of n-heptane (5.3) in a 2 litre bottle.
Add twice 20 ml of tetrahydrofuran (5.2) using a 20 ml volumetric pipette (6.6). Homogenize the mobile phase
by means of an ultrasonic bath (6.8) for 15 min.
5.5 Methanol.
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 HPLC system, consisting of a high-pressure pump, a sample injection device, column thermostat
adjusted to 25 °C (optional), a fluorescence detector with the excitation wavelength set at 295 nm and
emission wavelength at 330 nm, and a recording integrator.
An ultraviolet (UV) detector may be used if a fluorescence detector is not available but it is not recommended.
However, if a UV detector is used, the wavelength should be set at 292 nm.
1) Merck Tocopherol set 613424 is available from Calbiochem (www.calbiochem.com). It contains one 50 mg vial each
of DL-α-tocopherol, D-β-tocopherol, D-γ-tocopherol, and D-δ-tocopherol with a purity of 95 % by HPLC (for each component).
Merck Tocotrienol set 613432 is available from Calbiochem also. It contains one 50 mg vial each of α-tocotrienol,
β-tocotrienol, γ-tocotrienol, and δ-tocotrienol with a purity of 95 % by HPLC (75 % for γ-tocotrienol).
This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an
endorsement by ISO of these products.
2 © ISO 2006 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 9936:2006(E)
6.2 HPLC analytical column, two types are possible:
⎯ 250 mm × 4 mm, packed with microparticulate diol having a mean particle size of about 5 µm, or
⎯ 250 mm × 4,6 mm, packed with microparticulate silica having a mean particle size of about 5 µm.
NOTE 1 Suitable diol silica column packing material available commercially is 5 µm LiChrospher 100 Diol; suitable
2)
silica column packing materials available commercially are 5 µm LiChrosob SI 60 and Kromasil 100 . When β-tocotrienol
is expected in the sample, the diol silica column is preferred as γ-tocopherol and β-tocotrienol are co-eluted when using
the silica column.
NOTE 2 The length and the diameter of the column can be varied according to the HPLC technique used.
6.3 UV spectrometer, capable of absolute measurement of absorbance at precisely defined wavelengths,
with a 10-mm path length cell.
6.4 Rotary evaporator.
6.5 Graduated cylinder, of 1 000 ml capacity.
6.6 Volumetric pipettes, of 5 ml, 10 ml and 20 ml capacities.
6.7 Volumetric flasks, 50 ml and 25 ml capacities.
6.8 Ultrasonic bath.
7 Sampling
A representative sample should be sent to the laboratory. It is important that the sample has not been
damaged or changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
is given in ISO 5555.
8 Preparation of test sample
In the case of liquid laboratory samples, prepare the test sample by homogenization as described in ISO 661,
except that filtration should be avoided.
In the case of solid samples, transfer a representative portion (i.e. not less than 10 % by mass of the
laboratory sample) to a glass beaker and carefully homogenize by melting, with gentle mixing, in a water bath
at a temperature not exceeding 40 °C.
Preparation of the test samples should be carried out, as far as is practicable, in subdued light and in all cases
out of direct sunlight.
2) These types of columns are examples of suitable products which are available commercially.
This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an
endorsement by ISO of these products.
© ISO 2006 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 9936:2006(E)
9 Procedure
IMPORTANT — In general, the oxidation of tocols during the analysis may lead to low results. The rate
of oxidation is increased in the presence of alkalis, or under the influence of heat or light, and
measures should be taken to guard against these influences.
9.1 Preparation of calibration solutions
9.1.1 Stock calibration solutions
Prepare a stock solution of each tocol by weighing 10 mg ± 1 mg of the standard (5.1) into a 50 ml volumetric
flask and diluting to the mark with n-heptane (5.3).
Pipette 5 ml of this solution into an amber glass round-bottomed flask and remove all n-heptane on a rotary
evaporator (6.4) under vacuum at a temperature not greater than 40 °C. Restore atmospheric pressure with
nitrogen and remove the flask from the evaporator as soon as all the solvent has been removed. Pipette into
the flask 10 ml of methanol (5.5) and swirl to dissolve the residue. Measure the maximum absorbance of this
solution in a wavelength range between 270 nm and 310 nm (see appropriate wavelength in Table 1) using
the UV spectrometer (6.3) with a 10-mm path length cell. The measured absorbance should be between 0,2
and 0,8. Calculate the concentration (in micrograms per millilitre) by dividing the absorbance value by the
appropriate factor given in Table 1.
Table 1 — Division factors
Wavelength
Tocopherol Division factor
nm
292 0,007 6
α-tocopherol
296 β-tocopherol 0,008 9
298 γ-tocopherol 0,009 1
298 0,008 7
δ-tocopherol
NOTE The factors quoted are derived from the E values (1 %/1 cm) of the tocopherols. For
example, the E value (1 %/1 cm) of α-tocopherol is 76 at 292 nm (in methanol); therefore a 1 µg/ml
solution of α-tocopherol will have an absorbance of 0,007 6 at 292 nm.
9.1.2 Standard solution
A suitable standard solution should be prepared, according to the sensitivity of the fluorescence detector used.
The following preparation of working solution is given as an example: mix appropriate volumes, for example
1 ml, of the stock calibration solutions (9.1.1) to obtain a mixed tocol standard solution, and dilute with
n-heptane to give a solution containing between 1 µg and 5 µg of each standard per millilitre.
The standard solution shall be freshly prepared each working day.
Protect all solutions from light and store them at between 0 °C and 4 °C.
Stock standard solutions can be satisfactorily stored in amber glassware for up to 1 week if refrigerated.
Flasks may be wrapped in aluminium foil.
NOTE If a UV detector is used, a more concentrated solution might be needed.
4 © ISO 2006 – All rights reserved
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 9936:2006(E)
9.2 Optimization of working parameters
9.2.1 If the column (6.2) is new or of unknown history, or if for any other reason it is necessary to condition
it, wash and condition it for about 10 min with methanol, then dichloromethane, followed by n-heptane at a
flow rate of about 1 ml/min.
Pump the HPLC mobile phase (5.4) through the column at a flow rate of 1 ml/min for at least 30 min.
WARNING — Methanol and dichloromethane are hazardous to humans and to the environment.
Handle them with care.
9.2.2 Inject 10 µl or 20 µl (according to detector sensitivity) of the standard solution (9.1.2) into the column
and, if necessary, adjust the tetrahydrofuran content of the mobile phase and the flow rate to achieve the
following conditions:
a) α-tocopherol retention time between 8 min and 12 min;
b) resolution factor RF for the separation of β- and γ-tocopherols of not less than 1,0; i.e. almost baseline
separation, where RF is calculated using the following formula:
ddII− I
() ( )
rr
RF=
⎡⎤
0,5⋅+bbI II
() ()
⎣⎦
where
d (I) is the retention distance of γ-tocopherol;
r
d (II) is the retention distance of β-tocopherol;
r
b(I) is the width at the base of the γ-tocopherol peak;
b(II) is the width at the base of the β-tocopherol peak.
9.2.3 Select the optimum settings for the detection and integration system. Inject 10 µl or 20 µl of the
standard solution (9.1.2). Repeat the injec
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 9936
Deuxième édition
2006-04-15
Version corrigée
2006-08-01
Corps gras d'origines animale et
végétale — Détermination des teneurs
en tocophérols et en tocotriénols par
chromatographie en phase liquide à
haute performance
Animal and vegetable fats and oils — Determination of tocopherol and
tocotrienol contents by high-performance liquid chromatography
Numéro de référence
ISO 9936:2006(F)
©
ISO 2006
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 9936:2006(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
© ISO 2006
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax. + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2006 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 9936:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 2
7 Échantillonnage . 3
8 Préparation de l'échantillon pour essai. 3
9 Mode opératoire . 4
9.1 Préparation des solutions d'étalonnage . 4
9.2 Optimisation des paramètres de travail . 5
9.3 Préparation de la solution d'essai. 5
9.4 Détermination. 5
10 Expression des résultats . 6
11 Fidélité . 7
11.1 Essai interlaboratoire . 7
11.2 Répétabilité. 7
11.3 Reproductibilité. 7
12 Rapport d'essai . 7
Annexe A (informative) Exemple de chromatogrammes. 8
Annexe B (informative) Saponification . 10
Annexe C (informative) Résultats des essais interlaboratoires . 12
Bibliographie . 17
© ISO 2006 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 9936:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 9936 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 11,
Corps gras d'origines animale et végétale.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 9936:1997), dont elle constitue une
révision technique.
La présente version corrigée incorpore les modifications suivantes:
Tableau C.2, page 14
«α-Tocophérol» a été remplacé par «α-Tocotriénol»;
«β-Tocophérol» a été remplacé par «β-Tocotriénol»;
Tableau C.2, page 15
«γ-Tocophérol» a été remplacé par «γ-Tocotriénol»;
«δ-Tocophérol» a été remplacé par «δ-Tocotriénol».
iv © ISO 2006 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 9936:2006(F)
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination des
teneurs en tocophérols et en tocotriénols par chromatographie
en phase liquide à haute performance
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour la détermination des teneurs en α-, β-, γ- et
δ-tocophérols et tocotriénols libres (appelés globalement tocols) des graisses et des huiles (appelés corps
gras dans la suite du texte) d'origines animale et végétale, par chromatographie en phase liquide haute
performance (CLHP).
Pour les produits contenant des esters de tocophérols ou de tocotriénols, il est nécessaire qu'ils subissent
une saponification préalable.
NOTE Une méthode appropriée incluant un protocole de saponification à froid est décrite, pour information
uniquement, dans l'Annexe B.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 661, Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation de l'échantillon pour essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
teneur en tocol
fraction massique des différents tocols, déterminée suivant la méthode spécifiée dans la présente Norme
internationale
NOTE Cette teneur est exprimée en milligrammes par kilogramme, en nombre entier.
4 Principe
Une prise d'essai est dissoute dans du n-heptane et les différents tocols sont séparés par chromatographie en
phase liquide à haute performance. La teneur de chaque tocol est calculée à l'aide de facteurs d'étalonnage
déterminés à partir de solutions étalons.
© ISO 2006 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 9936:2006(F)
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité CLHP ou équivalente.
5.1 Étalons α-, β-, γ- et δ-tocophérol et -tocotriénol.
Si l'on ne dispose pas d'étalons pour les tocophérols, il est possible d'utiliser un mélange d'huile de germe de
blé et d'huile de soja pour identifier les α-, β-, γ- et δ-tocophérols.
Si l'on ne dispose pas d'étalons pour les tocotriénols, on peut utiliser de l'huile de palme pour identifier les α-
et γ-tocotriénols. Les chromatogrammes obtenus peuvent aider à l'identification des pics sur les
chromatogrammes des échantillons pour essai, auquel cas il convient d'utiliser les facteurs d'étalonnage
correspondant aux différents tocophérols.
1)
NOTE On peut se procurer les étalons α-, β-, γ- et δ-tocophérol et -tocotriénol auprès de la société Merck ,
α-tocophérol étant disponible auprès de différents fournisseurs. Une certaine variabilité de la pureté des étalons du
commerce, qui peut aller de 85 % à 100 %, a été signalée dans plusieurs cas. Ceci confirme l'importance de la
détermination, par spectrométrie UV, de la concentration des solutions d'étalonnages préparées (voir 9.1.1).
5.2 Tétrahydrofuranne, filtré à travers un filtre en nylon pour CLHP (0,45 µm).
5.3 n-heptane, filtré à travers un filtre en nylon pour CLHP (0,45 µm).
5.4 Phase mobile pour CLHP: il convient d'utiliser tout mélange approprié de solvants (voir Tableau C.3),
atteignant une résolution chromatographique des pics aussi bonne que celle présentée dans le Tableau 2
(temps de rétention relatifs des tocophérols et des tocotriénols) et dans l'Annexe A (chromatogrammes d'un
mélange d'huiles végétales).
La préparation d'une phase mobile appropriée, solution à 3,85 % (fraction volumique) de tétrahydrofuranne
dans le n-heptane, est indiquée ici. À l'aide d'une éprouvette graduée de 1 000 ml (6.5), introduire 1 000 ml de
n-heptane (5.3) dans un flacon de 2 litres. Ajouter deux fois 20 ml de tétrahydrofuranne (5.2) à l'aide d'une
pipette jaugée de 20 ml (6.6). Homogénéiser la phase mobile en la plaçant pendant 15 min dans un bain à
ultrasons (6.8).
5.5 Méthanol.
6 Appareillage
Utiliser un matériel courant de laboratoire et, en particulier:
6.1 Système CLHP, comprenant une pompe haute-pression, un dispositif d'injection de l'échantillon, un
chauffe-colonne réglé sur 25 °C (facultatif), un fluorimètre dont la longueur d'onde d'excitation est réglée sur
295 nm et la longueur d'onde d'émission sur 330 nm, et un intégrateur enregistreur.
Si l'on ne dispose pas d'un fluorimètre, il est admis, mais non recommandé, d'utiliser un détecteur UV. Si l'on
utilise un détecteur à UV, il convient de régler sa longueur d'onde sur 292 nm.
1) Le mélange commercial de tocophérols Merck 613424 est disponible auprès de Calbiochem (www.calbiochem.com).
Il se compose de flacons contenant chacun 50 mg de DL-α-tocophérol, D-β-tocophérol, D-γ-tocophérol et D-δ-tocophérol
d'une pureté de 95 % par CLHP (pour chaque composant). Le mélange commercial de tocotriénols Merck 613432 est
également disponible auprès de Calbiochem. Il se compose de flacons contenant chacun 50 mg de α-tocotriénol,
β-tocotriénol, γ-tocotriénol et δ-tocotriénol d'une pureté de 95 % par CLHP (75 % pour le γ-tocotriénol).
Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que
l'ISO l'approuve ou recommande l'emploi exclusif de ces produits
2 © ISO 2006 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 9936:2006(F)
6.2 Colonne analytique pour CLHP, 2 types sont possibles:
⎯ colonne de 250 mm × 4 mm, garnie de microparticules de silice greffée par des groupements diols
d'un diamètre moyen de 5 µm environ, ou
⎯ colonne de 250 mm × 4,6 mm, garnie de microparticules de silice d'un diamètre moyen de 5 µm environ.
NOTE 1 Le LiChrospher 100 Diol (diamètre de 5 µm) disponible dans le commerce convient pour le garnissage de la
2)
colonne de silice greffée par des groupements diols, le LiChrosob SI 60 et le Kromasil 100 également disponibles dans
le commerce convenant pour le garnissage de la colonne de silice. Si l'on s'attend à la présence de β-tocotriénol dans
l'échantillon, il convient de choisir la colonne de silice greffée par des groupements diols car le γ-tocophérol et le
β-tocotriénol sont coélués en cas d'utilisation de la colonne de silice.
NOTE 2 On peut adapter la longueur et le diamètre de la colonne en fonction de la technique CLHP employée.
6.3 Spectromètre UV, permettant le mesurage absolu de l'absorbance à des longueurs d'onde définies
avec précision, avec une cellule de 10 mm de longueur de trajet.
6.4 Évaporateur rotatif.
6.5 Éprouvette graduée, d'une capacité de 1 000 ml.
6.6 Pipettes jaugées, d'une capacité de 5 ml, 10 ml et 20 ml.
6.7 Fioles jaugées, d'une capacité de 50 ml et 25 ml.
6.8 Bain à ultrasons.
7 Échantillonnage
Il convient d'envoyer un échantillon représentatif au laboratoire. Il est important que l'échantillon n'ait pas été
endommagé ou modifié lors du transport ou de l'entreposage.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
méthode d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 5555.
8 Préparation de l'échantillon pour essai
Dans le cas d'échantillons pour laboratoire liquides, préparer l'échantillon pour essai par homogénéisation,
comme décrit dans l'ISO 661, en omettant toutefois la filtration.
Dans le cas d'échantillons solides, placer une portion représentative (c'est-à-dire au moins égale à 10 % en
masse de l'échantillon pour laboratoire) dans un bécher en verre et homogénéiser soigneusement en laissant
fondre dans un bain d'eau réglé à une température de 40 °C maximum, tout en mélangeant doucement.
Dans la mesure du possible, il convient de préparer les échantillons pour essai en lumière atténuée mais, en
aucun cas, à la lumière directe du soleil.
2) Ces types de colonnes sont des exemples de produits appropriés disponibles dans le commerce.
Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que
l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif de ces produits.
© ISO 2006 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 9936:2006(F)
9 Mode opératoire
IMPORTANT — D'une manière générale, l'oxydation des tocols au cours de l'analyse peut conduire à
l'obtention de résultats anormalement faibles. L'oxydation par l'oxygène étant accélérée par la
présence de substances basiques, la chaleur ou l'exposition à la lumière, il convient de prendre les
mesures nécessaires pour empêcher l'action de ces facteurs.
9.1 Préparation des solutions d'étalonnage
9.1.1 Solutions étalons mères
Préparer une solution étalon mère de chacun des tocols: pour ce faire, peser 10 mg ± 1 mg de l'étalon (5.1) et
les placer dans une fiole jaugée de 50 ml, puis compléter jusqu'au trait avec du n-heptane (5.3).
Transférer à la pipette 5 ml de cette solution dans un ballon à fond rond en verre ambré et éliminer totalement
le n-heptane dans un évaporateur rotatif (6.4), sous vide et à une température inférieure ou égale à 40 °C.
Rétablir la pression atmosphérique avec de l'azote et sortir le ballon de l'évaporateur dès élimination complète
du solvant. Introduire à la pipette 10 ml de méthanol (5.5) dans le ballon et remuer pour dissoudre le résidu.
Mesurer l'absorbance maximum de cette solution à une longueur comprise entre 270 nm et 310 nm (voir la
longueur d'onde appropriée dans le Tableau 1) à l'aide du spectromètre UV (6.3) avec une cellule de 10 mm
de longueur de trajet. Il convient que l'absorbance mesurée se situe entre 0,2 et 0,8. Calculer la concentration
(en microgrammes par millilitre) en divisant la valeur de l'absorbance par le facteur approprié donné dans le
Tableau 1.
Tableau 1 — Facteurs de division
Longueur d'onde
Tocophérol Facteur de division
nm
292 α-tocophérol 0,007 6
296 β-tocophérol 0,008 9
298 γ-tocophérol 0,009 1
298 δ-tocophérol 0,008 7
NOTE Les facteurs indiqués sont calculés à partir de la valeur E (1 %/1 cm) des tocophérols. La
valeur E (1 %/1 cm) de l'α-tocophérol, par exemple, est égale à 76 nm à 292 nm (dans le méthanol);
une solution à 1 µg/ml d'α-tocophérol aura donc une absorbance de 0,007 6 nm à 292 nm.
9.1.2 Solution étalon
Il convient de préparer une solution étalon appropriée, en fonction de la sensibilité du fluorimètre utilisé.
La préparation suivante d'une solution de travail est donnée à titre d'exemple: mélanger des volumes
appropriés, par exemple 1 ml, des solutions étalons mères (9.1.1) pour obtenir une solution étalon contenant
un mélange de tocols, et diluer avec du n-heptane de façon à obtenir une solution contenant entre 1 µg et
5 µg de chaque étalon par millilitre.
Il faut préparer chaque jour une nouvelle solution étalon.
Protéger toutes les solutions de la lumière et les stocker à une température comprise entre 0 °C et 4 °C.
Les solutions étalons mères se conservent convenablement pendant 1 semaine si elles sont réfrigérées et
stockées dans des fioles en verre ambré. Les fioles peuvent être enveloppées dans des feuilles d'aluminium.
NOTE Si l'on utilise un détecteur UV, il peut être nécessaire de travailler avec des solutions plus concentrées.
4 © ISO 2006 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 9936:2006(F)
9.2 Optimisation des paramètres de travail
9.2.1 Si la colonne (6.2) est neuve ou son historique inconnu, ou s'il est nécessaire de la conditionner pour
une autre raison, il est alors possible de la laver et de la conditionner pendant environ 10 min au méthanol,
puis au dichlorométhane, puis au n-heptane sous débit de 1 ml/min environ.
Utiliser la pompe pour faire circuler la phase mobile pour CLHP (5.4) dans la colonne à un débit de 1 ml/min,
pendant au moins 30 min.
AVERTISSEMENT — Le méthanol et le dichlorométhane sont des produits dangereux pour l'homme et
l'environnement. Les manipuler avec précaution.
9.2.2 Injecter, dans la colonne, environ 10 µl ou 20 µl (selon la sensibilité du détecteur) de la solution étalon
(9.1.2) et, si nécessaire, ajuster la teneur en tétrahydrofuranne de la phase mobile et le débit pour que les
conditions suivantes soient réalisées:
a) temps de rétention de l'α-tocophérol compris entre 8 min et 12 min;
b) facteur de résolution RF égal ou supérieur à 1,0 pour la séparation des β- et γ-tocophérols, c'est-à-dire
séparation des pics presque au niveau de la ligne de base, RF étant calculé selon
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.