Footwear and footwear components -- Quantitative challenge test method to assess antifungal activity

This document specifies quantitative challenge test methods for evaluating the antifungal activity of footwear and footwear components. This document is applicable only to footwear and components that claim to have antifungal (antimycotic) properties or antimicrobial properties. Two methods can be applied. The choice of method depends on the material properties and test microorganisms. Dynamic challenge test method can be applied to all types of materials. For single absorbent materials, static challenge test method is recommended. Brief descriptions of each method are given in 11.2 and 11.3.

Chaussures et composants de chaussure -- Méthode de test d'épreuve quantitatif pour évaluer l'activité antifongique

Le présent document spécifie des méthodes de test d'épreuve quantitatif permettant d'évaluer l'activité antifongique des chaussures et de leurs composants. Le présent document n'est applicable qu'aux chaussures et composants de chaussures pour lesquels des propriétés antifongiques (antimycotiques) ou antimicrobiennes sont revendiquées. Deux méthodes peuvent ętre appliquées. Le choix de la méthode dépend des propriétés du matériau et des micro-organismes d'essai. La méthode de test d'épreuve dynamique peut ętre appliquée ŕ tous types de matériaux. Pour les matériaux absorbants non combinés, il est recommandé d'appliquer la méthode de test d'épreuve statique. Des descriptions succinctes de ces méthodes figurent en 11.2 et 11.3.

General Information

Status
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Publication Date
20-Jan-2019
Technical Committee
Drafting Committee
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
28-Nov-2018
Completion Date
21-Jan-2019
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ISO 20150:2019 - Footwear and footwear components -- Quantitative challenge test method to assess antifungal activity
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ISO 20150:2019 - Chaussures et composants de chaussure -- Méthode de test d'épreuve quantitatif pour évaluer l'activité antifongique
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20150
First edition
2019-01
Footwear and footwear components —
Quantitative challenge test method to
assess antifungal activity
Chaussures et composants de chaussure — Méthode de test d'épreuve
quantitatif pour évaluer l'activité antifongique
Reference number
ISO 20150:2019(E)
ISO 2019
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 20150:2019(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2019

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Published in Switzerland
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ISO 20150:2019(E)
Contents Page

Foreword ..........................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Safety ................................................................................................................................................................................................................................ 2

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 2

7 Reagents and culture medium ............................................................................................................................................................... 3

7.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 3

7.2 Water ............................................................................................................................................................................................................... 3

7.3 Malt medium ............................................................................................................................................................................................. 3

7.3.1 Composition ......................................................................................................................................................................... 3

7.3.2 Preparation ........................................................................................................................................................................... 3

7.4 Malt extract agar (MEA) medium ............................................................................................................................................ 4

7.4.1 Composition ......................................................................................................................................................................... 4

7.4.2 Preparation ........................................................................................................................................................................... 4

7.5 Physiological saline (sodium chloride solution) ........................................................................................................ 4

7.5.1 Composition ......................................................................................................................................................................... 4

7.5.2 Preparation ........................................................................................................................................................................... 4

7.6 Wetting agent (nonionic surfactant) .................................................................................................................................... 4

7.7 Buffer solution ......................................................................................................................................................................................... 4

7.7.1 Buffer stock ........................................................................................................................................................................... 4

7.7.2 Preparation of buffer stock ..................................................................................................................................... 5

7.7.3 Preparation of buffer solution .............................................................................................................................. 5

8 Test microorganisms ........................................................................................................................................................................................ 5

9 Preparation of test inoculums ................................................................................................................................................................ 5

9.1 Indications for use of strains ...................................................................................................................................................... 5

9.2 Preparation of inoculums of Candida albicans ....................................................................................................... 6

9.3 Preparation of test spore suspension of filamentous micro-fungi ............................................................. 6

10 Preparation of test specimens ................................................................................................................................................................ 6

10.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 6

10.2 Test specimen ........................................................................................................................................................................................... 7

10.3 Pre-treatment of test specimen ................................................................................................................................................ 7

11 Test procedure ........................................................................................................................................................................................................ 7

11.1 Summary of test methods .............................................................................................................................................................. 7

11.2 Dynamic challenge tests ................................................................................................................................................................. 7

11.2.1 Inoculation ............................................................................................................................................................................ 7

11.2.2 Neutralization and elution after inoculation (time 0 h) ................................................................ 8

11.2.3 Incubation .............................................................................................................................................................................. 8

11.2.4 Neutralization and elution after incubation (time 24 h) ............................................................... 8

11.2.5 Determination of the number of viable micro-fungi ......................................................................... 8

11.3 Static challenge test ............................................................................................................................................................................ 8

11.3.1 Inoculation ............................................................................................................................................................................ 8

11.3.2 Neutralization and elution after inoculation (time 0 h) ................................................................ 9

11.3.3 Incubation .............................................................................................................................................................................. 9

11.3.4 Neutralization and elution after incubation (time 24 h) ............................................................... 9

11.3.5 Determination of the number of viable micro-fungi ......................................................................... 9

12 Expression of results ........................................................................................................................................................................................ 9

12.1 Calculation of the number of viable micro-fungi ....................................................................................................... 9

12.2 Judgement of test effectiveness ................................................................................................................................................ 9

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ISO 20150:2019(E)

12.3 Calculation of antifungal activity ratio ............................................................................................................................10

13 Test report ................................................................................................................................................................................................................10

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................12

iv © ISO 2019 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 20150:2019(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso

.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 216, Footwear.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
© ISO 2019 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20150:2019(E)
Footwear and footwear components — Quantitative
challenge test method to assess antifungal activity

CAUTION — Test methods specified herein require the use of micro-fungi. These tests are only

to be carried out in facilities with containment techniques for handling microorganisms and by

persons with training and experience in the use of microbiological techniques.
1 Scope

This document specifies quantitative challenge test methods for evaluating the antifungal activity of

footwear and footwear components.

This document is applicable only to footwear and components that claim to have antifungal (antimycotic)

properties or antimicrobial properties.

Two methods can be applied. The choice of method depends on the material properties and test

microorganisms. Dynamic challenge test method can be applied to all types of materials. For single

absorbent materials, static challenge test method is recommended. Brief descriptions of each method

are given in 11.2 and 11.3.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for

microbiological examinations
ISO 19952, Footwear — Vocabulary
3 Terms and definitions

For the purpose of this document, the terms and definitions given in ISO 19952 and the following apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
antifungal activity
antimycotic activity

efficacy of a material or finish used to prevent or mitigate the growth of micro-fungi, to reduce the

number of micro-fungi or to kill micro-fungi
3.2
control specimen
material identical to the test material but without antifungal treatment

Note 1 to entry: If no control specimen is available, sterilized conical flask can be used as control specimen.

© ISO 2019 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 20150:2019(E)
3.3
neutralizer

chemical agents used to inactivate, neutralize, or quench the antifungal properties of antifungal agents

[SOURCE: ISO 20743:2013, 3.7, modified — “antibacterial” has been replaced with “antifungal”.]

4 Principle

The test specimens and control specimens are inoculated with a spore suspension of a selected test

strain of micro-fungi specified or claimed. Two test methods are available to assess antifungal activity.

Antifungal performance is quantitatively determined by counting the number of viable micro-fungi and

calculating the antifungal activity ratio.
5 Safety

The handling of microorganisms which are potentially hazardous requires a high degree of technical

competence and can be subject to current national legislation and regulations. Only personnel trained

in microbiological techniques should carry out such tests.

NOTE: Refer to country-specific codes of practice for personal hygiene, disinfection and sterilization.

It is recommended that the person who perform the test should consult IEC 60068-2-10:2005,

Appendix A, and ISO 7218.
6 Apparatus
6.1 General

Disposable apparatus is an acceptable alternative to re-usable glassware and plastic if it has suitable

specifications.

Usual microbiological laboratory equipment in accordance with ISO 7218 and in particular the

following.
6.2 Biological safety cabinet.
6.3 Incubator, capable of maintaining a temperature of (28 ± 2) °C.

6.4 Autoclave, capable of maintaining a temperature of (121 ± 2) °C and a pressure of (103 ± 5) kPa,

for wet sterilization, used in accordance with ISO 7218.

6.5 Humidity chamber, capable of maintaining a temperature of (28 ± 2) °C and a relative humidity of

(85 ± 5) %.
6.6 Ultraviolet lamp.

6.7 Wide mouth jars, with cap, 100 ml, capable of being used with an autoclave (6.4).

6.8 Vortex mixer.
6.9 Centrifugal machine, 2 000 × g.

6.10 Dimensional shaker, two dimensional or three dimensional, capable of adjusting to 50 r/min.

2 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 20150:2019(E)

6.11 Shaking incubator, capable of maintaining a temperature of (28 ± 2) °C and a rotational frequency

of (120 ± 10) r/min.

6.12 Glass beads, 2 mm to 3 mm in diameter, 10 beads to 15 beads per conical flask, for preparation of

fungal spore solutions.

6.13 Glass wool or medical gauze (double layers), for preparation of fungal spore solutions.

6.14 Oven, for dry sterilization.
6.15 pH-meter, capable of measuring to ±0,2 units.
6.16 Balance, capable of weighing to ±0,01 g.

6.17 Spectrophotometer, capable of measuring at 500 nm to 660 nm wavelength, or McFarland’s

nephelometer.

6.18 Petri dishes, that have been sterilized, made of glass or plastic, in diameter sizes of 90 mm to

100 mm or 55 mm to 60 mm.
6.19 Pipette, having the most suitable volume for each use.
7 Reagents and culture medium
7.1 General

The preparation and test shall be freshly prepared in order to ensure the culture quality.

NOTE This could be done according to ISO 11133, or according to national standards or regulations.

Reagents used in tests shall be of analytical grade and/or suited for microbiological purposes.

7.2 Water

Water used in tests shall be analytical-grade water for microbiological media preparation, which is

freshly distilled and/or ion-exchanged and/or ultra-filtered and/or filtered with reverse osmosis.

It shall be free from all toxic or microorganism inhibitory substances.
7.3 Malt medium
7.3.1 Composition
Malt extract 30,0 g
Soya peptone 3,0 g
Water 1 000 ml
7.3.2 Preparation

Dissolve the designated amounts of components in distilled water, stir and adjust pH to (5,5 ± 0,2) at

room temperature, sterilize at (121 ± 2) °C for 15 min in an autoclave (6.4) with saturated water vapour.

© ISO 2019 – All rights reserved 3
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ISO 20150:2019(E)
7.4 Malt extract agar (MEA) medium
7.4.1 Composition
Malt extract 30,0 g
Soya peptone 3,0 g
Agar 15,0 g
Water 1 000 ml
7.4.2 Preparation

After mixing, stir and adjust pH to (5,5 ± 0,2) at room temperature. Heat with stirring on a hotplate

or in a boiling-water bath until the compo
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20150
Première édition
2019-01
Chaussures et composants de
chaussure — Méthode de test
d'épreuve quantitatif pour évaluer
l'activité antifongique
Footwear and footwear components — Quantitative challenge test
method to assess antifungal activity
Numéro de référence
ISO 20150:2019(F)
ISO 2019
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 20150:2019(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 20150:2019(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Sécurité ........................................................................................................................................................................................................................... 2

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 2

7 Réactifs et milieu de culture ..................................................................................................................................................................... 3

7.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 3

7.2 Eau ..................................................................................................................................................................................................................... 3

7.3 Milieu à l’extrait de malt ................................................................................................................................................................. 4

7.3.1 Composition ......................................................................................................................................................................... 4

7.3.2 Préparation ........................................................................................................................................................................... 4

7.4 Milieu de gélose à l’extrait de malt (MEA) ...................................................................................................................... 4

7.4.1 Composition ......................................................................................................................................................................... 4

7.4.2 Préparation ........................................................................................................................................................................... 4

7.5 Solution physiologique (solution de chlorure de sodium)................................................................................ 4

7.5.1 Composition ......................................................................................................................................................................... 4

7.5.2 Préparation ........................................................................................................................................................................... 4

7.6 Agent mouillant (tensioactif non ionique) ...................................................................................................................... 5

7.7 Solution tampon..................................................................................................................................................................................... 5

7.7.1 Solution tampon mère................................................................................................................................................. 5

7.7.2 Préparation de la solution tampon mère .................................................................................................... 5

7.7.3 Préparation de la solution tampon .................................................................................................................. 5

8 Micro-organismes d’essai ............................................................................................................................................................................ 5

9 Préparation des inoculums d’essai ................................................................................................................................................... 6

9.1 Indications relatives à l’utilisation des souches ......................................................................................................... 6

9.2 Préparation des inoculums de Candida albicans .................................................................................................. 6

9.3 Préparation de la suspension de spores d’essai de micromycètes filamenteux ............................. 7

10 Préparation des éprouvettes d’essai ............................................................................................................................................... 7

10.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 7

10.2 Éprouvette d’essai ................................................................................................................................................................................ 7

10.3 Prétraitement des éprouvettes d’essai ............................................................................................................................... 8

11 Mode opératoire d’essai................................................................................................................................................................................ 8

11.1 Résumé des méthodes d’essai ................................................................................................................................................... 8

11.2 Tests d’épreuve dynamiques ....................................................................................................................................................... 8

11.2.1 Inoculation ............................................................................................................................................................................ 8

11.2.2 Neutralisation et élution après inoculation (temps zéro) ............................................................ 8

11.2.3 Incubation .............................................................................................................................................................................. 9

11.2.4 Neutralisation et élution après incubation (temps 24 h) ............................................................. 9

11.2.5 Détermination du nombre de micromycètes viables ....................................................................... 9

11.3 Test d’épreuve statique .................................................................................................................................................................... 9

11.3.1 Inoculation ............................................................................................................................................................................ 9

11.3.2 Neutralisation et élution après inoculation (temps zéro) ............................................................ 9

11.3.3 Incubation ...........................................................................................................................................................................10

11.3.4 Neutralisation et élution après incubation (temps 24 h) ..........................................................10

11.3.5 Détermination du nombre de micromycètes viables ....................................................................10

12 Expression des résultats............................................................................................................................................................................10

12.1 Calcul du nombre de micromycètes viables................................................................................................................10

12.2 Jugement de l’efficacité de l’essai.........................................................................................................................................10

© ISO 2019 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 20150:2019(F)

12.3 Calcul du taux d’activité antifongique ..............................................................................................................................11

13 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................11

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................13

iv © ISO 2019 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 20150:2019(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos .html.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 216, Chaussure.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
© ISO 2019 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 20150:2019(F)
Chaussures et composants de chaussure — Méthode de test
d'épreuve quantitatif pour évaluer l'activité antifongique

PRÉCAUTIONS — Les méthodes d’essai spécifiées dans le présent document nécessitent

l’utilisation de micromycètes. Ces essais doivent être réalisés exclusivement dans des

installations comportant des dispositifs de confinement adaptés à la manipulation des

micro-organismes et par des personnes formées et expérimentées dans la mise en œuvre des

techniques microbiologiques.
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie des méthodes de test d’épreuve quantitatif permettant d’évaluer l’activité

antifongique des chaussures et de leurs composants.

Le présent document n’est applicable qu’aux chaussures et composants de chaussures pour lesquels des

propriétés antifongiques (antimycotiques) ou antimicrobiennes sont revendiquées.

Deux méthodes peuvent être appliquées. Le choix de la méthode dépend des propriétés du matériau et

des micro-organismes d’essai. La méthode de test d’épreuve dynamique peut être appliquée à tous types

de matériaux. Pour les matériaux absorbants non combinés, il est recommandé d’appliquer la méthode

de test d’épreuve statique. Des descriptions succinctes de ces méthodes figurent en 11.2 et 11.3.

2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 19952, Chaussures — Vocabulaire
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 19952 ainsi que les suivants

s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
activité antifongique
activité antimycotique

efficacité d’un matériau ou d’un apprêt servant à empêcher ou à limiter la croissance des micromycètes,

à réduire leur nombre ou à les tuer
© ISO 2019 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 20150:2019(F)
3.2
éprouvette témoin

matériau identique au matériau d’essai mais n’ayant pas subi de traitement antifongique

Note 1 à l'article: À défaut d’éprouvette témoin, une fiole conique stérilisée peut être utilisée en tant que telle.

3.3
neutralisant

agents chimiques servant à inactiver, neutraliser ou stopper les propriétés antifongiques des agents

antifongiques

[SOURCE: ISO 20743:2013, 3.7, modifiée — le terme «antibactérien(ne)s» a été remplacé par

«antifongiques».]
4 Principe

Des éprouvettes d’essai et des éprouvettes témoins sont ensemencées avec une suspension de spores

provenant d’une souche d’essai sélectionnée de micromycètes spécifiés ou revendiqués. Deux méthodes

d’essai sont disponibles afin d’évaluer l’activité antifongique.

L’efficacité antifongique est déterminée quantitativement en procédant au comptage des micromycètes

viables et en calculant le taux d’activité antifongique.
5 Sécurité

La manipulation de micro-organismes qui sont potentiellement dangereux nécessite un haut degré de

compétence technique et peut être soumise à la législation et aux règlementations nationales en vigueur.

Il convient que seul le personnel formé aux techniques microbiologiques puisse effectuer de tels essais.

NOTE Se référer aux codes nationaux de bonne pratique relatifs à l’hygiène personnelle, à la désinfection et à

la stérilisation.

Il convient que la personne réalisant les essais consulte l’IEC 60068-2-10:2005, Annexe A, et l’ISO 7218.

6 Appareillage
6.1 Généralités

Un appareillage jetable constitue une variante acceptable à la verrerie et au plastique réutilisables, si

ledit appareillage présente les spécifications appropriées.

Utiliser l’équipement de laboratoire microbiologique courant, conformément à l’ISO 7218, et notamment

les éléments suivants.
6.2 Poste de sécurité biologique.
6.3 Incubateur, permettant de maintenir une température de (28 ± 2) °C.

6.4 Autoclave, permettant de maintenir une température de (121 ± 2) °C et une pression de

(103 ± 5) kPa, pour stérilisation humide, utilisé conformément à l’ISO 7218.

6.5 Chambre en atmosphère humide, permettant de maintenir une température de (28 ± 2) °C et

une humidité relative de (85 ± 5) %.
6.6 Lampe à ultraviolets.
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6.7 Récipients à large ouverture, d’une contenance de 100 ml, munis d’un bouchon, pouvant être

utilisés en autoclave (6.4).
6.8 Agitateur vortex.
6.9 Centrifugeuse, 2 000 × g.

6.10 Agitateur, bidimensionnel ou tridimensionnel, pouvant être réglé à 50 r/min.

6.11 Incubateur à agitation, permettant de maintenir une température de (28 ± 2) °C et une fréquence

de rotation de (120 ± 10) r/min.

6.12 Billes de verre, d’un diamètre compris entre 2 mm et 3 mm, entre 10 billes et 15 billes par fiole

conique, utilisées pour la préparation des solutions de spores fongiques.

6.13 Laine de verre ou gaze médicale (double couche), utilisée pour la préparation des solutions de

spores fongiques.
6.14 Four, pour stérilisation à sec.
6.15 pH-mètre, permettant de mesurer à ± 0,2 unités près.
6.16 Balance, permettant de peser à ± 0,01 g près.

6.17 Spectrophotomètre, permettant de mesurer aux longueurs d’ondes comprises entre 500 nm et

660 nm, ou néphélomètre de McFarland.

6.18 Boîtes de Petri, en verre ou en plastique, stérilisées et dont le diamètre est compris entre 90 mm

et 100 mm ou entre 55 mm et 60 mm.
6.19 Pipette, présentant le volume le mieux adapté pour chaque utilisation.
7 Réactifs et milieu de culture
7.1 Généralités

Le milieu de culture doit être fraîchement préparé avant l’essai de manière à garantir la qualité de la

mise en culture.

NOTE Pour ce faire, il est possible de procéder selon l’ISO 11133 ou selon des normes ou réglementations

nationales.

Les réactifs utilisés lors des essais doivent être de qualité analytique et/ou adaptés à des fins

microbiologiques.
7.2 Eau

L’eau utilisée lors des essais doit être de qualité analytique pour la préparation des milieux

microbiologiques; cette eau est fraîchement distillée et/ou déionisée et/ou ultrafiltrée et/ou filtrée par

osmose inverse.

Elle doit être exempte de toute substance toxique ou inhibitrice de micro-organismes.

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7.3 Milieu à l’extrait de malt
7.3.1 Composition
Extrait de malt 30,0 g
Peptone de soja 3,0 g
Eau 1 000 ml
7.3.2 Préparation

Dissoudre les quantités de composants indiquées dans l’eau distillée, agiter et ajuster le pH à (5,5 ± 0,2)

à température ambiante. Stériliser à (121 ± 2) °C pendant 15 min en autoclave (6.4) à vapeur d’eau

saturée.
7.4 Milieu de gélose à l’extrait de malt (MEA)
7.4.1 Composition
Extrait de malt 30,0 g
Peptone de soja 3,0 g
Agar-agar 15,0 g
Eau 1 000 ml
7.4.2 Préparation

Après mélange, agiter et ajuster le pH à (5,5 ± 0,2) à température ambiante. Tout en agitant, chauffer sur

une plaque chauffante ou dans un bain-marie jusqu’à complète dissolution des composants. Stériliser

à (121 ± 2) °C pendant 15 min en autoclave (6.4) à vapeur d’eau saturée. Refroidir, bien agiter et verser

dans les boîtes de Petri.

NOTE La gélose dextrosée à la pomme de terre (PDA) peut également constituer un milieu de culture

complet pour la croissance de micromycètes. Le milieu PDA standard peut être obtenu dans le commerce, ce

qui permet de se dispenser des étapes préparatoires de cuisson et d’éviter les écarts liés à la composition des

différentes espèces de pommes de terre. Le milieu PDA du commerce, de composition standard, peut être utilisé

pour prévenir les influences dues à la composition des pommes de terre et à leur mode de préparation et de

cuisson. Le milieu de gélose à l’extrait de malt (MEA) peut également être obtenu dans le commerce.

7.5 Solution physiologique (solution de chlorure de sodium)
7.5.1 Composition
Chlorure de sodium, NaCl 8,5 g
Eau 1 000 ml
7.5.2 Préparation

Après avoir bien mélangé, ajuster le pH à (6,9 ± 0,2) à température ambiante et stériliser à (121 ± 2) °C

pendant 15 min.
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7.6 Agent mouillant (tensioactif non ionique)

Utilisé pour la récolte des spores, il est nécessaire qu’il ne réagisse pas avec d’autres réactifs et qu’il

n’entraîne ni augmentation ni réduction du nombre de micromycètes; par exemple: polysorbate 80

(TWEEN 80), N-méthyltauride, Triton X-100 , éther polyglycolique, etc.

NOTE L’agent mouillant (tensioactif non ionique) peut être utilisé lorsque l’éprouvette est enduite.

7.7 Solution tampon
7.7.1 Solution tampon mère
Dihydrogénophosphate de potassium, KH PO 34,0 g
2 4
Eau 1 000 ml
7.7.2 Préparation de la solution tampon mère

Préparer une solution tampon phosphatée en introduisant 34,0 g de dihydrogénophosphate de

potassium dans une fiole jaugée de 1 000 ml. Ajouter 500 ml d’eau et mélanger jusqu’à dissolution.

Ajuster le pH à (7,2 ± 0,2), à température ambiante, avec de l’hydroxyde de sodium. Ajouter de l’eau

distillée pour compléter au volume de 1 000 ml.
7.7.3 Préparation de la solution tampon

Transférer 1 ml de solution tampon mère et 0,08 g d’agent mouillant (tensioactif non ionique) (7.6),

soit 0,01 %, et diluer à 800 ml avec de l’eau distillée. Après avoir bien mélangé, stériliser à (121 ± 2) °C

pendant 15 min.

NOTE Si l’agent mouillant (tensioactif non ionique) n’est pas nécessaire, il est possible de s’en passer.

8 Micro-organismes d’essai
Les souches utilisées doivent être consignées dans le rapport d’essai.

Les espèces devant être utilisées pour les essais d’activité antifongique sont listées au Tableau 1.

1) TritonTM X-100 est l’appellation commerciale d’un produit distribué par SIGMA-ALDRICH. Cette information

est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou

recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est

démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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Tableau 1 — Souches d’essai
a o o o
Micromycètes Nom N WDCM N CGMCC N ATCC
TM b
Levure Candida albicans 00054 AS 1.2031 ATCC® 10231
TM b
Aspergillus niger 00144 AS 3.4463 ATCC® 6275
Micromycètes filamenteux/Moisissure
TM b
Aspergillus brasiliensis 00053 AS 3.5487 ATCC® 16404
TM b
Micromycètes filamenteux/Derma- Trichophyton menta- 00191 — ATCC® 9533
tophytes grophytes
Légende

WDCM: World Data Centre for Microogranisms (Centre mondial de données sur les micro-organismes)

CGMCC: China General Microbiological Culture Collection Centre (Centre général chinois de cultures microbiologiques)

ATCC®: American Type Culture Collection (Collection américaine de cultures types)

NOTE 1 Se référer au WDCM et à son site: http: //refs .wdcm .org.

NOTE 2 D’autres micromycètes (issus d’espèces ou d’autres souches appropriées) peuvent être utilisés après validation

appropriée.

Les souches d’essai doivent provenir des agences de la World Federation of Culture Collection (WFCC – Fédération

mondiale des collections de cultures). Les espèces de micromycètes et leur provenance doivent être consignées dans les

rapports d’essai.
b TM TM TM TM

ATCC® 10231 , ATCC® 6275 , ATCC® 16404 et ATCC® 9533 sont des exemples de produits appropriés

disponibles sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie

nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif des produits ainsi désignés.

L’essai à la levure (Candida albicans) est obligatoire.

Lorsqu’une activité antimoisissure est revendiquée, il doit être procédé à l’essai avec une souche de

moisissure.

Lorsqu’une activité antidermatophyte est revendiquée, il doit être procédé à l’essai au Trichophyton

mentagrophytes.

Les souches peuvent être conservées conformément aux indications du fournisseur ou selon l’EN 12353.

9 Préparation des inoculums d’essai
9.1 Indications relatives à l’utilisation des souches
Utiliser les souches sous 4 générations au maximum.
9.2 Préparation des inoculums de Candida albicans

9.2.1 À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, transférer une colonie de Candida albicans dans 20 ml

de milieu à l’extrait de malt (7.3) et incuber dans l’incubateur à agitation à (28 ± 2) °C pendant 16 h à

20 h environ (culture nocturne), ou incuber sur une plaque de milieu PDA standard à (28 ± 2) °C pendant

24 h à 48 h environ.

9.2.2 Préparer une solution tampon (7.7) fraîche, sans agent mouillant (tensioactif non ionique) (7.6),

et utiliser ce milieu pour préparer une suspension. Estimer le nombre de cellules de levure en utilisant

la méthode par dénombrement sur plaque de gélose, la méthode spectrophotométrique ou toute autre

méthode appropriée, avec des inoculums d’essai présentant une concentration en levure comprise entre

5 5
1,0 × 10 UFC/ml et 5,0 × 10 UFC/ml.

Si nécessaire, conserver les inoculums d’essai à température ambiante et les utiliser dans les 2 h.

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9.3 Préparation de la suspension de spores d’essai de micromycètes filamenteux

9.3.1 Ensemencer la surface du milieu MEA (7.4) (ou PDA) avec les spores de micromycètes et

incuber à (28 ± 2) °C jusqu’à ce que la surface soit totalement recouverte de spores de micromycètes

(1 semaine à 2 semaines environ pour Aspergillus et 2 semaines à 3 semaines environ pour Trichophyton).

9.3.2 Introduire, dans chaque tube ou plaque de culture, 5 ml de solution physiologique (7.5). Un agent

mouillant (tensioactif non ionique) (7.6) non toxique peut être ajouté, avec une concentration finale de

0,01 %. Racler doucement la surface de la culture sporulante à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile,

afin d’obtenir une suspension aqueuse de spores. Agiter doucement le tube ou la plaque de culture pour

disperser les spores dans le liquide. Évacuer les spores en versant le liquide dans une fiole conique stérile

contenant des billes de verre stériles. Répéter 2 fois ce mode opératoire avec chaque tube ou plaque

de culture. Agiter la fiole conique pour obtenir une suspension de spores parfaitement homogène. Pour

chaque culture fongique, la suspension de spores est filtrée au moins 2 fois à travers des doubles couches

de gaze médicale ou de laine de verre, afin de retirer les fragments mycéliens ou les blocs de gélose et de

séparer les spores agglomérés.

Centrifuger, en conditions d’asepsie, la suspension de spores filtrée avec une force centrifuge de 2 000 g

pendant 1 min; éliminer la couche supérieure de liquide. Remettre le résidu en suspension dans 20 ml de

solution physiologique (7.5) et centrifuger à nouveau. Répéter le lavage des spores au moins 3 fois selon

cette méthode. Diluer les suspensions de spores avec la solution tampon (7.7). Ajuster la concentration

6 6

à une valeur comprise entre 1,0 × 10 spores par millilitre et 5,0 × 10 spores par millilitre, en la

déterminant à l’aide d’une cellule de comptage. D’autres méthodes appropriées peuvent également être

employées pour déterminer la concentration en spores. Utiliser la suspension de spores fraîchement

préparée ou la stocker entre 2 °C et 8 °C au réfrigérateur dans les 3 jours suivant la préparation.

NOTE En raison du taux de récupération éventuellement plus faible des spores fongique

...

Questions, Comments and Discussion

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